بیماری نیوکاسل یکی از مخرب ترین بیماری های ویروسی طیور در سرتاسر جهان است. باتوجه به اینکه روش های سنتی قابلیت محدودی در کنترل این بیماری دارند، هدف از انجام این مطالعه استفاده از تکنولوژی های نوین برای تشخیص به موقع بیماری جهت کاهش خسارت پیش روی صنعت طیور می باشد. در این مطالعه به منظور تشخیص ویروس نیوکاسل، یک روش REAL-TIME-PCR بهینه سازی گردید. استخراج RNA با استفاده از کیت RNease mini (شرکت کیاژن، آمریکا) و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده استخراج شد.RNA استخراج شده با 68.23×109 رونوشت اولیه به صورت سری رقت های 100ml برای انجام واکنش REAL-TIME PCR تهیه شد. در این آزمایش از سویه B1 واکسن ویروس استفاده شد. آزمایش REAL-TIME-PCR با استفاده از کیت تجاری ساخت شرکت Genekam Biotechnology کشور آلمان انجام شد. حساسیت واکنش REAL-TIME PCR با توجه به سری رقت های تهیه شده 34-10×1 رونوشت/میکرولیتر تعیین گردید. با توجه به اینکه سرعت و دقت تشخیص ویروس نیوکاسل در همه گیری ها، نقش مهمی در کنترل بیماری دارد. استفاده از این روش به عنوان یک روش تشخیصی با حساسیت بالا توصیه می گردد.

یکی از چالش های موجود در تفسیر نتایج qPCR، اطمینان از اختصاصی بودن قطعات تکثیر شده است که برای بررسی آن از آنالیز منحنی ذوب استفاده می شود. پیک های اضافی در منحنی ذوب همیشه نشان دهنده یک مشکل نیست، به همین منظور در این مقاله یک ابزار مبتنی بر وب به نام uMelt SM به عنوان راهکاری کاربردی و ساده برای آنالیز صحیح منحنی ذوب به محققین پیشنهاد می گردد که امکان پیش بینی منحنی ذوب DNA و پروفیل های واسرشته سازی را با وضوح بالای فلورسنت از محصولات PCR فراهم می کند. نتایج این مطالعه نشان داد که منحنی های ذوب براساس چه پارامترهایی تولید شده و الگوریتم مناسب برای نحوه کار با این نرم افزار ارائه گردید. در نهایت ژن های اکتین و سوپراکسید دیسموتاز از قارچ Pyricularia oryzae به عنوان الگوی مناسب برای تعیین منحنی پیش بینی شده با استفاده از این نرم افزار ارائه گردید و منحنی REAL-TIME PCR نیز ترسیم شد. براساس نتایج منحنی ذوب با استفاده از نرم افزار uMelt SM در مقایسه با منحنی ذوب دستگاه REAL-TIME PCR تطابق بالایی را نشان می دهد که این نتایج تأییدی بر مزیت هایی همچون سهولت استفاده، صرفه جویی در زمان، هزینه و تلاش در بخش تجربی با استفاده از این نرم افزار می باشد.

طی سال های 1388-1389 از روش REAL TIME RT-PCR و RT-PCR معمولی جهت شناسایی ویروس زبان آبی در 310 گوسفند مشکوک به بیماری زبان آبی استفاده شد. قطعاتS1  (ژن پلی مراز) و S10 (ژن NS3) بعنوان ژنهای حراست شده در گروه سرمی زبان آبی به ترتیب توسط  rRT-PCR و RT-PCR معمولی مورد آزمایش قرار گرفتند و در نهایت تعداد 58 (%18.6) و 14 (%4.5) نمونه مثبت شناسایی شدند. جهت ارزیابی حساسیت rRT-PCR نسبت به RT-PCR معمولی از رقت های لگاریتمی RNA ویروس زبان آبی (BTV16) استفاده شد. نتایج حاکی از آن بود که با روش RT-PCR عیار بیش 103.8 TCID50/ml قابل شناسایی است، در حالیکه در روش rRT-PCR مرز تشخیص در حد101.8 TCID50/ml  از RNA ویروس در نمونه های بالینی می باشد. در این مطالعه مشخص شد روش rRT-PCR از حساسیت فوق العاده ایی برخوردار است. دام هائی که در انتهای بیماری هستند و عیار ویروسی در خون آنها بسیار کاهش یافته است با این روش قابل شناسایی می باشند. در این مطالعه سعی شد از برخی از نمونه های مثبت که باروش rRT-PCR شناسایی شدند، جداسازی ویروس صورت گیرد. برای این منظور از روش تزریق به عروق کوریوآلانتوئید تخم مرغ جنین دار و کشت سلول Vero و KC استفاده شد. علیرغم تلاش های صورت گرفته جداسازی ویروس امکان پذیر نشد.

روش REAL-TIME PCR در سال های اخیر به عنوان روشی انتخابی جهت تشخیص بسیاری از بیماری های عفونی در آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار گرفته است. با استفاده از این فن آوری، واکنش زنجیره پلیمراز توسط مولکول های گزارش گر فلورسنت انجام و از این طریق، تولید فرآورده های تکثیری طی هر چرخه واکنش PCR گزارش می شود. بدین ترتیب مجموعه ای از خصوصیات از جمله، حساسیت و اختصاصیت بالا، داده های قابل اعتماد و خطر پایین آلودگی، فن آوری REAL-TIME PCR را به جایگزینی مناسب برای PCR معمولی تبدیل کرده است. این روش اغلب در تعیین کمیت سطوح بیان ژن نیز مورد استفاده قرار می گیرد. از آنجایی که تمامی مراحل REAL-TIME PCR در داخل یک لوله دربسته انجام می شود، خطر ایجاد آلودگی در آن در مقایسه با PCR معمولی بسیار کاهش یافته و در نتیجه از حصول نتایج مثبت کاذب جلوگیری می شود. هدف از این مقاله، مرور کلی در مورد انواع مختلف روش REAL-TIME PCR، مزایا و کاربردهای آن می باشد.

در این تحقیق از روش مولکولی  REAL TIME PCRبرای اندازه گیری کپک رایزوپوس اوریزا در رب گوجه فرنگی استفاده شد. به دلیل مشکلات روش شمارش کپک ها به روش شماره نسبی کپک ها از قبیل احتمال خطای آزمون کننده، دقت کم و عدم تکرارپذیری، تبیین یک روش استاندارد که بتواند با دقت و تکرارپذیری بالا تشخیص و شمارش کپک ها را امکان پذیر سازد ضروری به نظر می رسد. روش مولکولی  REAL TIME PCRمی تواند به عنوان یک روش مناسب برای شناسایی و اندازه گیری کمی دقیق کپک ها مطرح باشد که بر مبنای اندازه گیری مطلق و نسبی ژن های کپک های موجود می باشد. نمونه های رب گوجه فرنگی با مقادیر مختلف اسپور کپک (101، 103 و 105) در هر گرم آلوده شد. پس از گرمخانه گذاری و رشد اسپور کپک و ایجاد میسیلیوم استخراج  DNAاز هر نمونه با استفاده از روش السامرایی انجام شد. سپس با استفاده از واکنش PCR تعداد کپی DNA کپک با استفاده از شناساگر سایبر گرین و پرایمرهای مربوط به جنس رایزوپوس اوریزا تعیین شد. نتایج نشان داد که با افزایش مقدار  DNAکپک در نمونه های شاهد و تلقیح شده منحنی  REAL TIME PCRدر مقادیر CT کمتری به فاز لگاریتمی وارد می شوند. ضریب همبستگی خطی منحنی استاندارد در آزمون PCR REAL TIME (R2=0.943) بود که نشان دهنده یدقت تعیین کمی این آزمون می باشد. اختصاصی بودن واکنش با استفاده از منحنی ذوب پرایمرها تعیین شد و نشان داد که واکنش به طور کاملا اختصاصی انجام شده است.

هدف: کالپاستاتین در بافت عضله اسکلتی حیوانات یافت شده است و می تواند با سرکوب فعالیت کالپاین مانع از رشد بی رویه سلولی شود. دخالت کالپاین ها در آپوپتوزیز موضوعی است که هنوز مورد بحث است، اگرچه دخالت آنها محدود به انواع خاصی از سلول ها و محرک های خاص است. مطالعات مختلف نشان داده که این ژن در عملکرد رشد و کیفیت گوشت نقش دارد، لذا هدف این پژوهش بررسی میزان بیان ژن کالپاستاتین در بافت های مختلف بز کرکی راینی با استفاده از REAL TIME PCR بود. مواد و روش ها: در مجموع 21 نمونه بافتی شامل ماهیچه، کلیه، قلب، جگر، شش، طحال و چربی (از هر بافت 3 تکرار) از 3 بز کرکی راینی در هنگام کشتار در کشتارگاه تهیه شد. RNA کل استخراج و cDNA ساخته شد. برای برررسی میزان نسبی بیان ژن ها از واکنش REAL TIME PCR به روش SYBR Green استفاده شد. در این مطالعه از ژن گلیسرآلدئید 3 فسفات دهیدروژناز (GAPDH) به عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. برای تجزیه و تحلیل داده های حاصل از REAL TIME PCR از روش پی فافل استفاده شد. نتایج: برای ژن کالپاستاتین قطعه bp89 و برای GAPDH قطعه bp101 در همه نمونه ها مشاهده شد. نتایج REAL TIME PCR حاصل از این پژوهش نشان داد که ژن کالپاستاتین در تمامی بافت های بررسی شده (ماهیچه، کلیه، قلب، جگر، شش، طحال و چربی) بیان شده است و بیشترین سطح بیان در بافت قلب، طحال و جگر و کمترین سطح بیان در بافت چربی مشاهده شد. نتیجه گیری: نتایج نشان می دهد که ژن کالپاستاتین در بافت های مختلف بز گسترده است. همچنین این پژوهش اساسی را برای انجام پژوهش های بیشتر در مورد کالپاستاتین در بز کرکی راینی ایجاد نمود. پیشنهاد می شود که این مطالعه با تعداد دام بیشتر، جنس های مختلف، سنین متفاوت و مراحل فیزیولوژیکی گوناگون در نژادهای مختلف بز انجام شود تا بتوان به یک نتیجه گیری جامعی دست یافت.

هدف: ژن Dlk1 نقش مهمی در تنظیم توسعه و تکامل و تولید مجدد ماهیچه اسکلتی، تمایز ادیپوسیت ها، در تنظیم رشد سلول عضله و در تکثیر هپاتوبلاست و تشکیل گلبول های خون دارد. هدف این پژوهش بررسی میزان بیان ژن Dlk1 در بافت-های مختلف بز کرکی راینی با استفاده از REAL TIME PCR بود. مواد و روش ها: تعداد 18 نمونه بافتی شامل ماهیچه، کلیه، طحال، مغز، جگر و چربی (از هر بافت 3 تکرار) از 3 بز کرکی راینی در هنگام کشتار در کشتارگاه تهیه شد. RNA کل استخراج و cDNA ساخته شد. برای برررسی میزان نسبی بیان ژن ها از واکنش REAL TIME PCR به روش SYBR Green استفاده شد. در این مطالعه از ژن بتااکتین به عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. برای تجزیه و تحلیل داده های حاصل از REAL TIME PCR از روش پی فافل استفاده شد. نتایج: نتایج حاصل از این بررسی نشان داد که ژن DLK1 در تمامی بافت های بررسی شده (بافت ماهیچه، چربی، کلیه، طحال، جگر و مغز) بیان شده است و بیشترین سطح بیان در بافت ماهیچه و کلیه و کمترین سطح بیان در بافت طحال و مغز مشاهده شد. نتیجه گیری: این پژوهش اساسی را برای انجام پژوهش های بیشتر در مورد Dlk1 در بز کرکی راینی و سایر نژادهای دیگر بز و حتی دام و طیور بومی ایجاد نمود. پیشنهاد می شود که این مطالعه با تعداد دام بیشتر، جنس های مختلف، سنین متفاوت و مراحل فیزیولوژیکی گوناگون در نژادهای مختلف بز انجام شود تا بتوان به یک نتیجه گیری جامعی دست یافت.

در این تحقیق از روش مولکولی REAL TIME PCR برای اندازه گیری کپک آسپرژیلوس نایجر در رب گوجه فرنگی استفاده شد. به دلیل مشکلات روش شمارش کپک ها به روش Howard Method Count از قبیل احتمال خطای آزمون کننده، دقت کم و عدم تکرار پذیری، تبیین یک روش استاندارد که بتواند با دقت و تکرارپذیری بالا تشخیص و شمارش کپک ها را امکان پذیر سازد ضروری به نظر می رسد. روش مولکولی REAL TIME PCR می تواند به عنوان یک روش مناسب برای شناسایی و اندازه گیری کمی دقیق کپک ها مطرح باشد که بر مبنای اندازه گیری مطلق و نسبی ژن های کپک های موجود می باشد. نمونه های رب گوجه فرنگی با مقادیر مختلف اسپور کپک (101، 103 و 105) در هر گرم آلوده شد. پس از گرمخانه گذاری و رشد اسپور کپک و ایجاد میسیلیوم، استخراج DNA از هر نمونه با استفاده از روش al-sammari انجام شد. سپس با استفاده از واکنش REAL TIME PCR تعداد copy number مربوط به DNA کپک با استفاده از شناساگر سایبرگرین و پرایمرهای مربوط به جنس آسپرژیلوس نایجر تعیین شد. نتایج نشان داد که با افزایش مقدار DNA کپک در نمونه های شاهد و تلقیح شده منحنی REAL TIME در مقادیر CT کمتری به فاز لگاریتمی وارد می شوند. ضریب همبستگی خطی منحنی استاندارد در آزمون R2= 0.938 REAL TIME بود که نشان دهنده دقت تعیین کمی این آزمون می باشد. اختصاصی بودن واکنش با استفاده از منحنی ذوب پرایمرها تعیین شد و نشان داد که واکنش به طور کاملا اختصاصی انجام شده است.